低温肉制品是指在常压下通过蒸、煮、熏、烤等热加工过程使肉制品的中心温度控制在68～72 ℃，并且需要在0～4 ℃的低温环境下贮藏、运输及销售的一类肉制品。与高温肉制品（通常采用121 ℃、0.1 MPa的高温高压加热方式）相比，低温肉制品能够最大限度地保留肉类原有的营养成分及风味物质，是世界肉类产品的发展趋势。低温肉制品在蒸煮阶段一般采用68～72 ℃的杀菌工艺，冷却后在无菌车间进行切分，真空包装为此类肉制品的主要包装形式，保质期一般为2～4 周，保质期的长短主要取决于初始菌量及贮藏温度。

本研究对真空包装低温熟牛肉中的腐败菌进行菌株的培养、分离与纯化以及PCR扩增，通过扩增核糖体DNA限制性分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA），并对菌株的生理生化特性进行研究，为进一步采取有效的防腐保鲜措施、延长产品的货架期提供参考。

1、菌株的菌落特征及PCR鉴定结果

本研究分别采用涂布法和倾注法对菌株进行培养，根据样品稀释液在BHI培养基上所生长细菌菌落的表型差异，共筛选出12 株腐败菌，编号为n01～n12，12 株菌的基本形态特征如表1所示。菌株的分离和筛选主要依据其形态、颜色等特征，不排除筛选出同一种属、甚至同一菌株的可能性。

所有菌株经过PCR扩增（16S rDNA）后均出现了清晰可辩的特异性条带，条带大小为1 500 bp左右。其中菌株n01、n04、n05、n09、n10的PCR扩增结果如图1所示。

2、ARDRA结果

ARDRA是限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）在核糖体DNA序列上的应用。最初的RFLP技术的依据是不同生物个体之间DNA片段的酶切位点有所差异，经限制性内切酶消化后能够产生长短、种类、数目不同的限制性片段，基于对限制性片段的分析，从DNA水平比较不同个体之间的差异。ARDRA则是根据16S rDNA基因序列的限制性片段区分菌株种的差异。

12 株菌的16S rDNA分别经EcoRⅠ和SpeⅠ双酶切、TaqⅠ单酶切后，均可获得便于区分的酶切图谱。根据条带的相似性可以将12 株菌分为5 组，第1组包括n01、n02、n03和n08，第2组包括n05、n06和n07，第3组包括n09和n11，第4组包括n10和n12，第5组仅包括n04。同一组内菌株的酶切图谱具有较高的相似性，表明这些菌株之间存在一定的亲缘关系。

3、菌株系统进化树的构建

n01和n08与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、n02与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、n03与特基拉杆菌（Bacillus tequilensis）亲缘关系最近，它们均属于芽孢杆菌属（Bacillussp.）；n04与嗜冷杆菌属（Psychrobactersp.）亲缘关系最近；n05、n06和n07与魏斯氏菌属（Weissellasp.）亲缘关系最近；n09和n11与链球菌属（Streptococcussp.）亲缘关系最近；n10和n12与肠球菌属（Enterococcussp.）亲缘关系最近。

4、菌株的生理生化鉴定结果

参照GenBank比对结果，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行相应的生理生化鉴定。由表2可知，n01和n08为枯草芽孢杆菌，n02为解淀粉芽孢杆菌，n03为特基拉芽孢杆菌，n04为嗜冷杆菌属的Psychrobacter urativorans（暂无中文命名），n05、n06和n07为魏斯氏菌属中的绿色魏斯氏菌，n09和n11为巴黎链球菌，n10和n12为粪肠球菌。

结论

本研究对真空包装低温熟牛肉中的腐败菌进行分离，并结合表型分析、ARDRA、系统进化树的构建对菌株进行鉴定。结果表明，分离得到的12 株菌中，4 株为芽孢杆菌属，3 株为绿色魏斯氏菌，2 株为巴黎链球菌，2 株为粪肠球菌，1 株为嗜冷杆菌。其中，绿色魏斯氏菌是导致样品变绿的主要原因，总体来说，乳酸菌是真空包装低温熟肉制品中的主要腐败菌。本研究为进一步采取有效的防腐保鲜措施、延长低温肉制品的货架期提供了理论依据。